D-二聚体是在凝血级联过程中交联纤维蛋白的水解产物，它在血浆中的浓度和深静脉血栓、肺栓塞、弥散性血管内凝血等疾病的诊断密切相关。目前临床上对血浆中D-二聚体的定量都是基于抗体的检测方法，但由于D-二聚体固有的不均一性，导致不同抗体试剂盒检测结果难以一致，不同医院在诊断中D-二聚体浓度截断值也无法统一，从而无法实现疾病诊断的标准化。近期，我组报道了一种基于质谱的免抗体方法，可以实现血浆样品中D-二聚体的绝对定量，具有临床使用的潜力。相关成果以“A Mass-Spectrometry-Based Antibody-Free Approach Enables the Quantification of D‑Dimer in Plasma”为题发表在国际化学权威杂志Journal of Proteome Research上（J Proteome Res, 2020, 19: 3143-3152；DOI：10.1021/acs.jproteome.0c00148）。

    研究中我们通过富集检测D-二聚体蛋白中特异性的交联肽段来实现D-二聚体蛋白的定量，该交联肽段可以很好地区分非交联纤维蛋白酶解产物和交联纤维蛋白的其他水解产物，从而实现D-二聚体蛋白特异性定量。首先，我们利用该交联肽段的分子量较大（~4K）比一般胰蛋白酶解肽段大，使用3K的超滤管进行酶解，将分子量较小的肽段离心除去，在酶解时降低样品的复杂程度。然后，利用该交联肽段含有4个组氨酸，通过Ni(Ⅱ)-IMAC特异性与组氨酸共价结合的性质对其进行特异性富集，通过优化条件除去含有较少组氨酸的肽段。最后，采用平行反应监测模式（prallel reaction monitoring, PRM）进行数据采集和Skyline进行D-二聚体的定量。文章中我们优化了D-二聚体碎裂的能量、酶解步骤、Ni(Ⅱ)-IMAC富集条件、PRM母离子子离子对的选择，考察了富集每步回收率和定量的重现，进行了方法定量的线性、检测限和定量限的考察。该定量方法表现出高的回收率和较好的重现性，定量线性范围为3.125 nmol/L - 400 nmol/L跨越两个数量级，线性相关系数可达到0.99。检测限为1.25 nmol/L，定量限为3.125 nmol/L，该定量限可以实现血浆中低浓度的D-二聚体定量。进一步通过对25例临床血浆样品中D-二聚体进行定量，其结果和试剂盒检测结果具有很好的相关性，表明该D-二聚体方法定量的准确性和潜在的应用价值。

  本研究中我们发展了一种免抗体的D-二聚体绝对定量方法，该方法可以实现对实际血浆样品中不同浓度D-二聚体蛋白的定量检测。这种完全不基于抗体的检测方法可以避免抗体差异和抗原不均一性的问题从而对D-二聚体定量方法的标准化具有重要意义。该方法也展示了使用基于质谱的靶向蛋白质组学方法对蛋白质类生物标志物进行检测定量的优越性及其潜在的临床使用价值。    （文/图    张娜）