近日，我组叶明亮研究员、秦洪强研究员与中科院上海药物所黄蔚研究员团队合作，提出并构建了O-乙酰氨基葡萄糖基化（O-GlcNAc）糖肽的可逆酶促化学标记策略，并与亲水作用色谱富集方法相结合，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏度检测，为生物样品中蛋白质O-GlcNAc糖基化的高覆盖度检测提供了一种简便有效的手段。相关研究成果以“Endo-M Mediated Chemoenzymatic Approach Enables Reversible Glycopeptide Labeling for O-GlcNAcylation Analysis”为题，发表在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed.）上https://doi.org/10.1002/ange.202117849。

         O-GlcNAc修饰主要发生在丝氨酸或苏氨酸（Ser/Thr）的残基，是一种重要的蛋白质翻译后修饰（PTM），参与调控细胞代谢、信号转导、免疫应答等生理过程。由于O-GlcNAc的低丰度、高度动态变化性，极大地增加了富集与分析的难度。目前，现有的抗体等非共价作用富集策略存在亲和力低、富集效率低等问题；化学酶促标记法等富集策略虽然显著提高了糖肽富集的特异性，但是该策略引入大质量标签，降低了糖肽的鉴定效率。

针对上述问题，合作团队发展了一种基于O-GlcNAc糖肽的具有可逆标记的无损富集检测策略。该策略中，科研人员首先基于糖苷内切酶突变体Endo-M N175Q的转糖酶连接活性，实现O-GlcNAc糖单元中N-糖链基团的标记，从而提高O-GlcNAc糖肽的亲水性；接着，基于延长糖链的亲水性，采用亲水作用色谱方法对O-GlcNAc标记糖肽进行富集；最后，利用野生型糖苷内切酶Endo-M/S的水解活性，进行富集后糖肽中标记糖链的释放，实现O-GlcNAc糖肽的无痕富集，避免了标记糖链对O-GlcNAc糖肽鉴定效率的影响，以此实现了O-GlcNAc糖肽的无损富集与检测。

       我们还将该方法应用于HeLa细胞核蛋白质O-GlcNAc糖基化分析，从1.1mg蛋白样品中共鉴定到1414处潜在O-GlcNAc修饰位点，其中777处（约55%）在人源O-GlcNAc糖基化数据库中收录（1985-2020年），这极大程度补充了O-GlcNAc糖蛋白数据库的覆盖度。并且，本工作中鉴定到的O-GlcNAc糖蛋白中，包括识别RNA上N6-甲基腺苷（m6A）的YTHDF1和YTHDF3蛋白，以及与之形成相互作用网络的另外13种蛋白，后者与剧烈条件下应激小体的形成密切相关，为应激小体形成与蛋白质O-GlcNAc之间的作用机制研究提供了新线索。（图/文 秦洪强）