蛋白质糖基化是一种常见且重要的翻译后修饰，在肿瘤等多种疾病的发生和发展中都起着至关重要的作用。位点特异性糖型是非常有希望的肿瘤诊断标志物。糖链的变化已经用于辅助疾病的诊断，如核心岩藻糖修饰的甲胎蛋白（AFP）和核心岩藻糖修饰的前列腺特异性抗原(PSA)在区分肝细胞癌和前列腺癌方面分别优于AFP和PSA蛋白质本身。因此，在位点特异性水平上深入分析N-和O-糖型将有助于更好地揭示癌症发生发展规律并鉴定新的诊断标志物。然而，N-和O-糖基化的微观异质性和低丰度特性，糖肽富集实验步骤的耗时和繁琐以及鉴定灵敏度低，对其高通量且准确的鉴定构成了很大的挑战。
近期，我组发展了一种同时富集并鉴定N-和O-完整糖肽的方法。该方法根据亲水性差异将N-和O-完整糖肽选择性分离为两个馏分，具有较高的重现性。利用该课题组发展的Glyco-Decipher、MS-Decipher软件分别实现N-和O-糖肽的鉴定。该方法进一步应用于胃癌和健康对照血清样本的差异分析，共17条O-完整糖肽和181条 N-完整糖肽发生显著性变化。相关研究成果以“Development of an Integrated Platform for the Simultaneous Enrichment and Characterization of N- and O‑Linked Intact Glycopeptides”为题，于近日发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04305）。
与N-完整糖肽相比，O-完整糖肽的丰度较低。因此，对O-完整糖肽进行分析通常需要在富集糖肽之前酶切N-糖链以降低高丰度N-完整糖肽的干扰。然而，额外的步骤会造成样品损失，并且使整个样品制备过程繁琐而耗时。为了简化样品制备过程并实现N-和O-糖基化同时分析，本方法根据不同完整糖肽的亲水性，利用亲水相互作用实现N-和O-完整糖肽的同时富集与分离，使用HCD碎裂模式进行质谱分析，并结合两种不同的谱图解析方法进行糖肽鉴定（图1）。叶明亮课题组发展的Glyco-Decipher软件（Nat. Commun.，2022）基于非糖库依赖的肽段序列鉴定方法，能够实现N-糖肽的高灵敏鉴定，并揭示未知糖链及修饰糖，课题组发展的MS-Decipher软件（Anal. Chem., 2019; Bioinformatics, 2022）将糖型设置为肽水平上的质量标签并进行O-完整糖肽检索，能够提供糖型组成及潜在的糖基化位点信息。
图1. 用于同时分析N-和O-完整糖肽的集成平台示意图
首先，基于上述工作站，富集并分析了人血清酶解肽段在乙腈梯度下的15个馏分，其结果显示人血清糖肽在很大程度上被唾液化，带负电荷的唾液酸会增强其在HILIC材料上的保留（图2、图3）。方法开发实验中应用的分级策略可以成功鉴定具有相同肽段序列但被不同的糖链异构体或具有相似分子量（<1 Da）的糖型修饰的N-完整糖肽。
图2. 人血清分级实验中N-完整糖肽的特征。(A)15个馏分中鉴定的N-完整糖肽谱图，N-完整糖肽和N-糖型。(B) 15个馏分中N-糖型所含糖单元的平均数。(C) 15个馏分中不同种类N-糖型的比例。(D) 15个馏分中N-糖型所含唾液酸数的比例。(E)P01871蛋白上鉴定的位点特异性糖型在单针富集和分级方法之间的比较。
图3. 人血清分级实验中O-完整糖肽的特征。(A) 15个馏分中鉴定的O-完整糖肽谱图和O-完整糖肽。(B)P01042蛋白上鉴定到的N-和O-完整糖肽。
进一步，根据15个馏分中鉴定到的N-和O-完整糖肽的百分比，将酶解的血清样品分为两个馏分，第一个馏分以O-完整糖肽为主（85.1%），第二个馏分以N-完整糖肽为主(93.4%)。该方法进行了技术重复及质谱重复实验，其皮尔森相关系数、变异系数与单针富集法相当，展现较好的定量重现性（图4）。之后，该方法进一步应用于胃癌和健康对照血清样本的差异分析，共17条O-完整糖肽和181条 N-完整糖肽发生显著性变化（图5）。其中，五种糖蛋白同时存在N-和O-糖基化显著性变化。
图4. (A)两个馏分中鉴定的N-和O-完整糖肽。(B)3次质谱和技术重复鉴定的N-完整糖肽。(C)在馏分2中，3次质谱和技术重复鉴定的N-完整糖肽。(D)定量 N-完整糖肽在质谱重复和技术重复中的Pearson相关系数。(E)定量N-完整糖肽在质谱重复和技术重复中的C.V.(%)。
图5. （A)胃癌患者和健康对照人血清中鉴定的O-和N-完整糖肽。(B)胃癌患者与健康对照人血清的O-和N-完整糖肽的差异表达（P<0.05，倍数变化>2）。
本工作发展了一种基于亲水相互作用色谱，用于同时富集和鉴定同一血清样品的N-和O-完整糖肽的方法。该方法操作简便，成本低，重现性好。本方法的分级策略可以成功鉴定具有相同肽段序列但被不同的糖链异构体或具有相似分子量（<1 Da）的糖型修饰的N-完整糖肽。总体来讲，这种在蛋白质组学规模上同时富集和鉴定N-和O-完整糖肽的方法是分析位点特异性糖型的有效工具。该研究工作被科研公众号“分析人”进行了特别推送报道 https://mp.weixin.qq.com/s/5Fx1tbH3lVhM6Q1i278eTA。（文/图 王钟毓）
