（李柯佳个人简介：本科毕业于华东理工大学。博士师从大连化学物理研究所叶明亮研究员，主要从事配体靶蛋白鉴定方法的开发，在此期间发展了高灵敏的以肽段为中心的蛋白局部稳定性探测技术（PELSA），该研究成果于近期发表在Nature Methods上。2024年至今在欧洲分子生物学实验室进行博士后研究，合作导师为Mikhail Savitski博士，主要从事代谢物在细菌中的调控网络以及蛋白质衰老的相关研究。）

收到叶老师的消息，说贺老师希望我写一篇关于PELSA的回顾文章。这让我有机会再次回顾这段研究历程，也感谢贺老师提供了这样一个交流的机会，促使我完成了这篇回顾。虽然PELSA文章上线才一个多月，但距离第一次投稿已经过去了四年多。

我于2016年毕业于华东理工大学药学院制药工程专业。华东理工大学以化学见长，但在选专业时，面对化学院众多抽象的化学、化学分子与工程、高分子等专业，我毫不犹豫地选择了应用性更强的制药工程。在华东理工大学杨丙成老师的推荐下，我来到大连化物所1809组读研。2017年，我在中科大完成了一年的代培后，正式进入实验室。当时实验室主要有蛋白质组学和材料合成两个方向。叶老师询问我是否想进入材料方向，我表达了本科学习药物构效及药物与蛋白相互作用的兴趣，因此更倾向于蛋白质方向。叶老师表示，药物靶蛋白的鉴定正是组里未来重点发展的方向，我可以参与这个领域。我非常高兴，最终得以加入与本科专业契合的研究领域。

当时，叶老师对瑞士苏黎世联邦理工学院Paola Picotti课题组发展的LiP-MS技术非常感兴趣，并将相关文献转发给我们。随后，我们召开了小型会议，讨论是否可以用trypsin进行限制性酶切，并将这些有切口的大片段富集起来，进一步进行bottom-up分析。然而，由于实验步骤过于繁琐，这个计划最终不了了之。接着，我和王科云师兄尝试使用超滤来分离trypsin或lysC切下的肽段，观察是否对药物结合有响应，但最终只得到了2000多个肽段，无法达到蛋白质组深度分析的要求，不得不放弃。

后来，我转向了靶向半胱氨酸探针的方法。这个方法与SPROX的思路类似，即通过探针判断一系列不同变性剂浓度下半胱氨酸的反应性，进而推断蛋白质的稳定性，根据药物结合前后蛋白质稳定性的变化来鉴定药物结合蛋白。然而，这个实验也遇到了重重困难，屡战屡败。在最后一次关于这个课题的组会报告中，PPT背景原本是蓝白色花纹，结果放映时变成了黑白色，我自嘲这是在祭奠我“死去”的课题。

2018年6月，我已经在实验室待了近一年，做了许多实验，但课题却毫无进展。我开始认真思考是否要换一个探针。半胱氨酸的丰度是否太低，离药物结合口袋太远？是否应该换一个更广谱的探针？但如果探针太广谱，多个氨基酸都能反应，得到的产物将难以解析。因此，探针仍需高特异性。赖氨酸的丰度相对较高，且许多药物结合口袋附近都有赖氨酸，因此是否可以使用赖氨酸作为探针？在思考赖氨酸探针时，由于我读过许多Paola的文章，他们总是将Proteolysis称为structural probe，我突然想到trypsin不就是一个天然的赖氨酸探针吗？它不仅靶向赖氨酸，还靶向精氨酸。更巧的是，trypsin反应的产物是tryptic肽段，没有任何修饰，这不正是蛋白质组学最喜欢的肽段吗？于是，我开始尝试在蛋白质组中加入一系列不同浓度的盐酸胍，然后进行trypsin酶切，收集酶切下来的肽段。在探针测试时，通常会测试不同的探针浓度，因此我也测试了不同的trypsin浓度。当我得到第一次实验结果时，非常开心：无论是得到的肽段浓度，还是质谱鉴定到的肽段数目，几乎都随着变性剂浓度的提高而增加，说明trypsin可以作为一个蛋白质稳定性探针。唯一的例外是，在不加入任何变性剂时，回收到的肽段量和鉴定到的肽段数目是最多的（这是因为尽管酶切时稀释了变性剂浓度，变性剂仍会对trypsin的活性产生影响）。此外，随着蛋白酶浓度的提高，鉴定到的蛋白和肽段数目也越来越多，几乎能达到常规蛋白质组的水平。因此，我开始放弃不同的变性剂浓度，转而使用不同的酶浓度来描绘蛋白质的稳定性曲线。由于TMT的使用成本较高，在测试药靶鉴定时，我选择了两个蛋白质组覆盖度较高的酶浓度点进行测试。至今记得，那是我第一次看到药物结合蛋白通过我亲手做的实验被筛选出来，第一次彻底相信科学理论和实验的力量。随后的实验优化和数据分析进展得非常顺利。由于这个方法的结果输出是在肽段层次上，我们能够通过肽段丰度的高低判断蛋白质的局部稳定性，因此我们称这个方法为“以肽段为中心的蛋白质局部稳定性探测方法（PEptide-centric Local Stability Assay）”，即PELSA。随后，我们使用多个模型药物将PELSA应用于多种人源细胞系，PELSA均能非常特异性地鉴定出药物结合蛋白。与此同时，实验室的小伙伴也在测试LiP-MS方法，发现大部分情况下LiP-MS并不奏效，这也让我们进一步认识到了PELSA的价值。

我们在2019年就开始准备文章的构思和写作。在此之前，LiP-MS由于样品复杂度高，应用仅限于原核生物体系，因此我们的创新点是将其应用于复杂真核生物体系，能够鉴定药物结合蛋白和结合区域。然而，2020年初，多剂量版本的LiP-MS，即LiP-Quant上线了。LiP-Quant的主要创新在于通过多个药物剂量和严格的数据筛选，使得LiP-MS能够应用于复杂的人源细胞系。我当时感到有些失落，觉得这下没有创新点了。后来，阮成飞和王龑师兄建立了DIA方法，用于取代TMT在TPP中蛋白质的定量。PELSA方法在此之前均采用二甲基标记，而文献中的LiP-MS方法则一直采用DIA。因此，我也开始尝试将DIA用于PELSA，并与文献中的LiP-MS数据进行比较。第一次的实验结果让我们倍加振奋：在测试模型药物星孢菌素时，如果要求真阳性率大于80%，我们使用一个药物剂量就鉴定到了89个激酶靶蛋白，而与此同时，LiP-Quant使用7个药物剂量仅鉴定到了9个激酶靶蛋白。后来，上海药物所的罗成老师和复旦的党永军老师（现任职于重庆医科大学）来化物所交流。他们听了我们的介绍后，给出了许多宝贵的意见。在PELSA文章的第一个版本中，我们与罗老师讨论后选择了一系列不同结构的热休克蛋白抑制剂作为应用出口。PELSA鉴定到了多个非常有意思的脱靶蛋白。在后续验证工作中，罗教授课题组的陈示洁老师为我们提供了关键的技术支持，成功验证了这些脱靶蛋白。特别值得一提的是，PELSA技术测得的亲和力数据与罗老师实验室采用纯化蛋白方法获得的结果高度一致，这一发现令我们备受鼓舞。

在文章写作时，叶老师开始与我讨论，说文章要投CELL。我一方面非常开心，叶老师认为这个工作是靶标鉴定领域的一大突破，但更多的是忐忑和不安，我连CELL的文章都没完整看过一篇，还能投CELL？事实证明，叶老师的眼光果然深远。在第一次投CELL时，大约一周后，也就是2021年的大年初一，编辑就送审了。后来我们满怀期待，但迎来的却是被拒的消息。其中，第二个审稿人比较积极，但希望我们提供非常详细的protocol；第一个审稿人则对我们的实验数据持怀疑态度，提出需要提供各种层次的原始数据；第三个审稿人则有明显的偏见，尽管我们在文章中展示了PELSA相比LiP-MS有10倍的灵敏度提升，但ta仍形容PELSA“marginally outperforms LiP-MS”，并提出PELSA在弱相互作用和膜蛋白方面的能力未得到展示。看到这些意见，我们没有感到沮丧，反而非常有动力，因为这些问题都是非常容易解决的。因此，我们向编辑提出了appeal，编辑认同我们的说法，并提出根据我们的修改结果决定是否送审。经过半年多的补实验、优化条件，并撰写了近20,000字的回复。在这个版本中，我们更强调了PELSA在弱相互作用中的应用，并充分展示了PELSA在代谢物、金属离子、抗体和翻译后修饰的结合蛋白鉴定中的能力。在文章结尾，我们系统比较了正常代谢物和肿瘤代谢物在不同细胞中的作用图谱，得到了丰富的相互作用数据并提供了亲和力数据。罗老师实验室再次提供了关键验证支持。

此轮修改让我们更加坚信PELSA在生物学和药物研发领域的重大意义。我们信心满满地重新提交后，编辑也顺利送审了。然而，一个多月后，我们再次迎来了被拒的消息。我们非常失落，尤其是第三个审稿人，我们回复了ta的所有意见后，ta没有针对回复提出任何意见，仅仅表示“not excited about the paper”；而第一个审稿人则怀疑我们的结果是否因为质谱条件好。虽然我们对这个结果感到不服，但觉得二次appeal的成功率也很低。在我们迷茫时，在瑞典卡罗林斯卡学院Par Nordlund（CETSA技术的首创者）组做博后的吕佳纹师姐与我们取得了联系。佳纹师姐说她也和Par提过我们的技术，Par对我们的技术非常感兴趣。佳纹师姐的正面反馈给了我们很大的信心。于是，我们又认真回复了所有意见，打算第二次appeal。在回复意见的过程中，我们再次被自己说服，越来越觉得这是个正确的选择。在此轮appeal过程中，Par也给予了极大的帮助和支持，在此表示感谢。与此同时，我们进一步增加了与LiP-MS在更多维度和实验数据上的比较，以说明PELSA在靶蛋白鉴定方面的突破。此轮appeal发给编辑后，她也很快回复说要仔细考虑并征求审稿人的意见。但此后进展非常缓慢，有时发邮件也不回，直到半年后，编辑告诉我们再次被拒。至此，我们在CELL经历了两年半的来回。

随后，我们尝试了Science，被拒后，转投Nature Methods。在Nature Methods审稿后，我在过年到家的第一天假期收到了被拒的消息。至此，真的是累觉不爱了。然而，正好是过年，而且年后我就要出国了，所以我决定不管怎样都要陪家人好好度过一个完整的假期，因此没有太多时间沉浸在文章被拒的失落中。出国后，各种事务进一步分散了我的注意力。在此之前，关于文章的任何风吹草动都会在我内心引起惊涛骇浪，尤其是害怕被scooped。出国后，各类事务不可避免地分散了我很多精力，使得我根本没有整片的时间去处理这个被拒的文章。感谢叶老师在此期间不断地鼓励和“push”，大大加快了文章进度。认真分析完审稿人的意见后，发现被拒的主要原因是文章太长，条理性不够，导致审稿人漏掉了许多关键点。因此，我们决定按照其中一个审稿人的意见，将文章改短，并在SI中增加了大量新的讨论和补充实验数据（感谢薛连基师弟），再次appeal。在此期间，非常感谢我的博士后合作导师Misha Savitski给予了我极大的支持和帮助，使我顺利完成appeal。Appeal的结果非常顺利，编辑和其团队商量后，很快决定再次送审。当我们以为最好的结果是再给我们一次修改的机会时，没想到这次审稿意见回来后，三个审稿人竟然全部都非常满意，几乎没有任何意见。编辑直接给了“Accepted in Principle”。之前在化物所读博时，我曾无数次幻想文章接收后要如何庆祝，要去吃大连最贵的自助，要在寝室躺个三天三夜……此刻在异国他乡，这些庆祝活动都无法实现，但我依旧感到无比开心。至此，从2018年课题开始，已经过去了六年多，无数个辗转难眠的夜晚，无数次破碎又得以重建，感谢叶老师，感谢所有帮助过我的人，感谢所有的co-authors。

文章的发表只是PELSA的开始，令人欣慰的是，目前国内外多个顶尖课题组和公司对PELSA技术表现出浓厚兴趣，并且反馈效果很好。未来，我非常期待看到PELSA技术在学术界和产业界真正助力生物发现和加速新药研发。

李柯佳

2025年2月2日于德国，海德堡